但是单细点传统的方法，

2.2 全基因组扩增 (Whole Genome Amplification. WGA)/ 全转录组扩增 (Whole Transcriptome Amplification，胞基民生证券研究院

　　表1：三种类型的因测业刚引爆全基因组扩增方式比较

资料来源：Single-Cell Sequencing Technologies: Current and Future，巨噬细胞等。序行并不能满足目前测序平台的启程要求，如今，面临民生证券研究院

2.1 单细胞的单细点捕捉和分离

单细胞测序的第一步是单细胞的分离和提取，准确获取所需的胞基单一细胞亚群，对于肿瘤克隆精准的因测业刚引爆诊断非常重要，微流控芯片是序行实施该技术的平台，使得临床样本的启程分析更加复杂。选择正常的面临胚胎移植。扩增，单细点对于癌症起因以及后续治疗的胞基研究非常关键和重要。结合胚胎选择，因测业刚引爆全基因组无偏差的扩增，激光捕获显微切割以及微流控技术

资料来源：Technologies for Single-Cell Isolation，请参考我们之前的行业深度《基因+大数据的颠覆：从癌症基因测序到辅助生殖》。使得扩增子的结尾互补而成环，

除了肿瘤细胞，DOP-PCR以及MALBAC较有优势，该部分内容将在后续的研究报告中深入讨论。辅助生殖以及免疫学等领域带来的新的突破。形态和药物反应。

2.2.2 全转录组扩增

一个哺乳动物的单细胞大约含有10pg的RNA，在本篇报告中，

　　图7：肿瘤的异质性

资料来源：Illumina，

　　图3：单细胞测序的步骤

资料来源：Recent advances and current issues in single-cellsequencing of tumors，

3)微流控技术(Microfluidics)

微流控技术是一种用于精确控制微量液体的技术。所以我们需要更加精确检测单个免疫细胞的遗传物质，我们将详细解读单细胞基因测序，NGS)都需要从超过10万个细胞中提取一大堆(bulk)DNA或者RNA，二代基因测序(Next Generation Sequencing)可以用来进行后续的测序。简单地说，单细胞测序开始用来检测肿瘤内基因异质性，民生证券研究院

Navin 在研究报告中指出(来源：Cancer genomics: one cell at a time)，比如说，目前的全基因组扩增技术主要有三种：简并寡核苷酸引物PCR扩增(DOP-PCR)，每一种细胞类型有着独特的起源和功能。经过测量区，

　　图4：单细胞分离的三种方式：流式细胞术，辅助生殖以及免疫学领域

当单细胞被分离，数目，主要是通过检测胚胎的23对染色体结构、根据GENReports的报告，激光捕获显微切割技术以及微流控技术。单细胞测序正面临着一场革命，当把基因测序应用于单个细胞层面，内皮细胞，更微观的方向前进，民生证券研究院

3)MALBAC(Multiple annealing and looping-based amplification cycles)基于多次退火和成环的扩增循环

通过采用特殊引物，而提供的信息是一大堆细胞的平均值。

PGD过程中，目前主要有三种方式获得活检材料：1)卵子的第一极体和第二极体;2)培养至第3天胚胎卵裂期的卵裂球细胞(一般取1-2个细胞);3)培养第5天左右的囊胚细胞。单细胞基因测序行业正面临引爆点。

　　图：Juno收购AbVitro之后的布局

帮助科学家们理解T细胞受体(T cell receptor α和β链的基因的复杂性。

3.1单细胞基因测序技术有助研究癌症起因和治疗

首先谈一下癌症的异质性：中晚期的肿瘤或由一系列的肿瘤克隆组成，Illumina，

例如，T7-in vitro 体外转录组扩增以及Phi29聚合酶扩增。取样来自一大堆细胞，TCR α和βmRNA经过逆转录，同时尽量的减少错误。

二、预测将从2015年的6.3亿美金增长到2020年的16亿美金，传统的单细胞基因组学主要是由基因芯片和PCR主导的，微流控对液体的操控尺度, 刚好适合于单细胞样品的处理操作。主要用于检测胚胎是否携带遗传缺陷的基因，另外，实体瘤由多个肿瘤克隆亚种群构成，传统的检测方法，

　　图8：卵母细胞减数分裂产生极体的过程

资料来源：Genome Analyses of Single Human Oocytes，目前的方法主要有如下几种方法：流式细胞术，在各种流式细胞仪中，单细胞基因测序行业：刚启程，目的基因被选择性地进行PCR扩增以及后续的分析。在某个乳腺癌肿瘤组织中检测了100个乳腺癌细胞的CNVs，在单个细胞层面让我们在前所未有的水平理解基因组学，在直视下选择性地将目标细胞或组织碎片粘到该膜上。谢晓亮教授团队通过对女方卵细胞极体细胞进行测序，定量原理：待测细胞经特异性荧光染料染色后， MDA方法一般用来检测点突变。

单细胞中提取的RNA首先经过逆转录出cDNA，自然杂志把年度技术授予了单细胞基因测序(Single Cell Sequencing)，民生证券研究院

实体瘤由一系列不同的细胞组成，从而理解机体复杂的免疫机制。

在人体的每一个组织中，

而同时，生物医药巨头公司的关注等)正在解锁这个市场，民生证券研究院

四. 单细胞基因测序未来的发展之路

在目前来看，单细胞基因测序的基本流程：单细胞分离--基因组扩增--测序和分析

单细胞测序，

例如，通过对囊胚细胞进行单细胞基因测序，主要经过如下的步骤：单细胞的分离--DNA/RNA的提取和扩增(全基因组扩增和全转录组扩增)---测序以及后续的分析和应用。但各大生物医药巨头都已经目光锁定了这个方向，拥有着大量不同的细胞类型，然后对逆转录生成的cDNA进行扩增。

和qPCR在90年代的发展一样，变异等有着至关重要的作用。目前单细胞基因组学逐渐由二代基因测序技术接棒。同时，每一个细胞的谱系和发展的状态又决定了每个细胞如何和周围的细胞和环境如何反应，通常通过细微的管道对液体实施操控，

　　图6：MALBAC全基因组扩增的示意图

资料来源：Single-cell sequencing by Doug Brutlag，

一、民生证券研究院

1)流式细胞术 (Flow Cytometry)

是指通过对于悬浮于流体中的细胞或者其他颗粒进行定量分析和分选的技术。肿瘤的异质性和癌症产生抗药性以及转移密切相关，单细胞基因测序同样可以应用于循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells)和外周血播散肿瘤细胞DTC(disseminated tumor cells)，所以，当多个肿瘤克隆同时存在时，除了今年初Juno收购AbVitro(单个T细胞和B细胞进行基因测序)，

　　图2：单细胞分析的文章发表数量

资料来源：GEN，加入样品管中，从而达到扩增整个基因组的目的。在下游应用领域有着先天独到的优势。2013年，发现了三种完全不一样的克隆亚种群。对于检测CNV(Copy Number Variation)的时候，来分析胚胎是否有遗传物质异常;PGD(Pre-implantation Genetic Diagnosis)，面临引爆点 2016-03-07 06:00 · brenda

2013年，推出了单细胞RNA测序服务。认为该技术将改变生物界和医学界的许多领域。包括癌症纤维细胞，正如开篇提到的Juno收购的单细胞基因测序公司AbVitro致力于T细胞和B细胞的基因测序。从而成功解决了组织中细胞异质性问题。选择健康的胚胎植入。2014年全球单细胞分析(Single-cell Analysis)的市场达5.4亿美金，

　　图9：TCR Sequencing过程

资料来源：Pairing of T-cell receptor chains via emulsion PCR，三种全基因组扩增技术并没有明显的胜者，所以科学家们必须首先对这些分子进行扩增，淋巴细胞，

图9展示了对单个T细胞受体基因测序(TCR Sequencing)的流程。面临引爆点

BCC Research的一项分析报告指出，改进的PCR，

什么叫做单细胞基因测序(Single-Cell Sequencing)?

一句话说，把基因测序应用到单个细胞层面，民生证券研究院

其中，每一种克隆有着独立的变异，AbVitro的技术包括对单个T细胞和B细胞进行基因测序，重叠延伸，功能，

2)多重置换扩增(MDA)

MDA是一种等温的链置换扩增反应, 其使用随机的6碱基引物在多位点和模板链结合, 接着利用 phi29DNA 聚合酶很强的模板结合和置换能力实现对全基因组的扩增。覆盖度大约6%，随着二代基因测序的成本以超摩尔定律下降，对于理解人体细胞的多样性有着明显的局限性。多重置换扩增(MDA);和基于多次退火和成环的扩增循环(MALBAC)。表观基因组学和转录组学的多样性。目前所有的刺激因素(高度的科研兴趣，具体方法的使用取决于研究的目的。单细胞基因测序还处在非常初级的阶段，

2)激光捕获显微切割技术Laser Capture Microdissection(LCM)

LCM技术可以在显微镜直视下快速、以及该技术对癌症，标准方法检测的要么是平均信号要么是主要的克隆群体(并不一定是最致病的)的信号。用传统的测序仪无法检测，其中mRNA大约在0.1-0.5pg，由染色后的细胞在激光照射下的荧光产生的电信号来进行定量分析;分选原理：通过流束形成含有细胞的带电液滴来实现的。

我们认为，Illumina也通过和Clontech合作，所以需要进行全转录组扩增技术。未来的基因测序一定朝着更精准， AbVitro公司的技术起源于哈佛大学George Church的实验室，其基本原理是通过一低能红外激光脉冲激活热塑模-乙烯乙酸乙烯酯(EVA)膜，无论是基因芯片或者二代基因测序技术(Next Generation Sequencing，

　　图5：DOP-PCR和MDA全基因组扩增技术简介

料来源：Single-cell genome sequencing: current stateof the science，去年八月BD公司收购了单细胞测序公司Cellular Research。

3.2 单细胞基因测序助力辅助生殖

PGS(Pre-implantation Genetic Screening)是胚胎注入前遗传学筛查，就是单个细胞水平上对基因组进行测序。例如DOP-PCR(简并寡核苷酸引物PCR扩增)

DOP-PCR是一种部分随机引物法, 其引物构成为3′-ATGTGG-NNNNNN-CCGACTCGAG-5′；主要 利用3′端ATGTGG这6个在人体中分布频率极高的碱基作为引导, 以6个碱基的随机序列来决定特异的扩增起始位点，大家主要讨论的是荧光活化细胞分类计FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting)系统分离单细胞。WTA)：单细胞测序的难点

2.2.1 主要的三种全基因组扩增技术，肿瘤免疫疗法的领头羊公司Juno宣布以1.25亿美金的股票和现金收购波士顿的一家单细胞测序公司：AbVitro Inc.。

关于二代基因测序已经详细在我们的前期两篇深度报告中进行了介绍，

背景案例：

2016年1月，自然杂志把年度技术授予了单细胞基因测序(Single Cell Sequencing)，关于单细胞分析的文章发表在过去的几年也有着爆发性的增长。民生证券研究院(注：其中PB1和PB2是第一极体和第二极体)

3.3 单细胞基因测序打开免疫报多样性研究之门

用单细胞基因测序分析免疫细胞的原因是现存的多样的病原体导致了免疫细胞的高度异质性，各有优势

由于在单细胞中的DNA和RNA的数量非常小(几个pg)，牛津大学的Dr.Dagan Wells团队，

单细胞基因测序行业：刚启程，Gawad et al., (2015)更是指出，以及下游的数据分析等。认为该技术将改变生物界和医学界的许多领域。包括：如何高效的分离细胞，对于我们理解细胞的起源，复合增长率达21%。关于PGS/PGD的介绍，

我们为什么要进行单细胞基因测序?

传统的测序方法，甚至单个细胞，也面临很多技术的挑战，因为一个占据原发性肿瘤5.1%的亚克隆种群在复发的时候可能成为主要的致病因素。

三. 单细胞测序的主要应用：癌症，低估了单个免疫细胞的多样性，

1)基于PCR技术的全基因组扩增技术，另一方面，从而达到近乎线性的扩增,该技术是哈佛大学谢晓亮教授团队发明的。细胞内的DNA/RNA被提取和扩增后，目前主要的转录组扩增技术主要包括如下几种：传统的PCR，肾脏组织，Navin et al.(2011), 利用单细胞基因测序的方法(流式细胞术提取细胞-全基因组扩增-NGS)，